Yeast electroporation

DAG 1

1. Inoculeer 4 ml YPD-medium
   Incubeer op 30°C tot een volgroeide cultuur

DAG 2

1. Ent 100 µl precultuur over in 100 ml voorverwarmd YPD-medium + incubeer overnacht op 30°C

DAG 3

1. Oogst de cellen bij een OD₆₀₀ = 1,3-1,5
   (4000.g - 10 min - 4°C)
2. Resuspendeer de celpellet 18 ml steriel H₂O
   Voeg 2 ml 10X TE-buffer pH7,5 toe
   Voeg 2 ml 10X LiAc-oplossing toe
   Schud voorzichtig gedurende 45 min op 30°C
3. Voeg 0,5 ml 1 M DTT toe
   Schud voorzichtig gedurende 15 min op 30°C
4. Verdun de celsuspensie tot 100 ml met water
   Oogst cellen (4000.g - 10 min - 4°C)
5. Was pellet
   - met 50 ml ijskoud water + cellen oogsten
   - met 5 ml ijskoude 1 M sorbitol + cellen oogsten
   - met 0,1 ml ijskoude 1 M sorbitol
6. Meng 40 µl geconcentreerde celsuspensie met ¾100 ng DNA
   Incubeer op ijs
7. Breng celsuspensie over in elektroporatiecuvet
   Puls : 1,5 kV; 25 µF; 200 Û
8. Voeg 1 ml ijskoud 1 M sorbitol toe
9. Uitplaten : 100 resp. 900 µl op selectief medium
   Incubeer op 30°C totdat kolonies verschijnen.

4 ml YPD-medium (voor precultuur)

100 ml YPD-medium

Steriele Sorvall-buizen

Steriel H₂O

1 M dithiothreitol (DTT) - filter-gesterilizeerd en bewaard bij -20°C

1 M sorbitol : filter-gesterilizeerd

10X TE-buffer

10X Lithiumacetaat-oplossing

• 1 M Lithium acetaat pH 7,5 (pH aangepast met verdund azijnzuur)
  Sterilizatie door filtratie

Vast selectief medium om transformanten uit te platen