Uit : "Refolding and single-step purification of porcine interferon-gamma form Escherichia coli inclusion bodies" K. VANDENBROECK et al., 1993. Eur. J. Biochem. 215 : 481-486.
Densiteitsgradiënt centrifugatie van inclusiepartikels :
- collecteer cellen (8 l cultuur)
- resuspendeer celpellet in 100 ml buffer A + 0,2 mg/ml lysozyme
- osmotische shock en sonicatie :
voeg 300 ml ijskoude 3 mM EDTA-oplossing toe
soniceer op ijs
pelleteer onoplosbare fractie door 25 min cetrifugatie bij 12000xg
- resuspendeer pellet in 100 ml buffer A
- herhaal osmotische shock en sonicatie
- resuspendeer pellet in 24 ml buffer B
- breng fracties van 3 ml op een stapgradiënt bestaande uit gelijke volumes van 67 %, 53 % en 40 % (massa/volume) sucrose oplossingen in 1 mM Tris/HCl pH8,0 + 1 mM EDTA.
- centrifugeer bij 108000xg gedurende 2 uren
- verwijder de inclusiepartikels van de 67%/53% interfase
- was de inclusiepartikels met bigedistileerd water
- bewaar bij -20°C
Samenstelling van de buffers :
Buffer A : 10 mM Tris/HCl pH 8,0
0,75 M sucrose
2 mM phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)
buffer B : 10 mM Tris/HCl pH 8,0
0,25 M sucrose
1 mM EDTA
Hervouwingsprocedure
Hervouwing wordt geïnitieerd door twaalfvoudige verdunning van een oplossing van inclusiepartikels (240 µM) in 6 M Gdn/HCl in 20 mM Na2HPO4/NaH2PO4 pH 7,0 tot de gewenste concentratie aan eiwitten en Gdn/HCl :
eindconcentratie Gdn/HCl : 0,5 M
eindconcentratie eiwit : 21 µM
gevolgd door een incubatieperiode van 16 uren bij 0°C.
Parameters van essentieel belang bij hervouwing :
a) snelle verlaging van de de Gdn/HCl-concentratie van de initiële 6 M naar de intermediaire waarde van 0,5 M (eerste stap), gevolgd door de volledige verwijdering van Gdn/HCl door size-exclusion chromatography (tweede stap).
b) temperatuur van 0°C
c) proteïne-concentratie van 10-20 µM
Met dit protocol wordt voor PoIFN-gamma een opbrengst van 60-70 % verkregen.
Aggregaat quantificatie
Reaggregatie tijdens in vitro hervouwing wordt gevolgd door meting van de turbiditeit bij 340 nm (Mulkerrin and Wetzel, 1989 : Biochemistry 28, 655-6561).
De hoeveelheid gevormd sedimenteerbaar eiwit bij verschillende Gdn/HCl concentraties wordt gekwantificeerd door een precipitatie assay (Horowitz and Criscimagna, 1986 : J. Biol. Chem. 261, 15652-15658).