In vivo karakterisatie van Cat_I-mutanten

Dag 1

Transformatie van 50 µl competente cellen van E. coli WK6 met gewenst DNA (± 20 stalen) volgens het heat shock protocol (blanco en pUCAT_I niet vergeten !)

Na 1 uur expressiefase worden transformanten op ijs gezet en als volgt uitgeplaat :

Incubatie van de platen op 37°C overnacht

BENODIGDHEDEN

Dag 2

Aflezen resultaten MIC-bepaling op vast medium

Bereiding van vriesculturen
Ent 4 ml LB(Ap-100) met geïsoleerde kolonies vanaf de Ap-100 plaat
Incubeer op 37°C en volg O.D.₆₀₀ tot een waarde van 0,6
Neem per staal 2 X '420 µl celsuspentie+80 µl glycerol (50 %)' en vries in op CO₂-ijs+ethanol
Bewaar celstocks bij -70°C

Ent 2X4 ml LB(Ap-100+IPTG) met 10 µl van de op ijs ontdooide -70°C celstock
Ent 2X4 ml LB met WK[blanco]
Ent 2X2x4 ml LB(Ap100) resp. LB(Ap100+IPTG) met WK6[pUCAT_I]
Incubeer overnacht op 37°C.

BENODIGDHEDEN
- 3X 4 ml vloeibaar LB-medium per staal

Dag 3

Meet O.D.₆₀₀ : indien lager dan 1.000, dan verdere incubatie op 37°C tot O.D.₆₀₀ > 1,000

Indien O.D.₆₀₀ > 1,000, maak een verdunning tot 1,000 en bewaar 8 ml van deze verdunning op ijs tot alle stalen klaar zijn.

Neem een fractie van 5 µl celsuspentie voor fasecontrastmikroskopie en bestudeer de celmorfologie bij de grootste vergroting (X1000 met immersie-olie).

Collecteer de cellen uit de 8 ml celsuspenties (O.D.₆₀₀=1) door centrifugatie van proefbuisjes in BIOFUGE bij 4000 rpm gedurende 10 min + verwijder supernatans

Resuspendeer celpellet in 2 ml ATRIT + 8 µl van een 50 mg/ml lysozyme-oplossing
15 min incubatie op 28°C
drie maal vriezen/dooien bij -70°C/kamertemperatuur
sonicatie : met microtip (rechtstreeks in suspentie)

Controleer cellysis door fasecontrastmikroskopie (indien onvoldoende cellysis, herhaal vries/dooien + sonicatie)

Breng 2 X 150 µl homogene suspentie van cellysaat over in epjes voor SDS-PAGE van de totale/oplosbare/onoplosbare eiwitfractie in cellysaat + vries in op -20°C

Breng 1,5 ml cellysaat in derde epje
Centrifugeer : 10 min bij 13000 rpm
Breng 1 ml supernatans over in nieuw epje
Maak een 1/10 en 1/100 verdunning van dit supernatans :

Gebruik 2X50 µl van de 1/1 verdunning voor de bepaling van de totale hoeveelheid oplosbaar eiwit met behulp van de SOPACHEM kit

Gebruik 2X10 µl van de 1/10 en de 1/100 verdunning voor de bepaling van de in vitro CAT-activiteit met de CAT-test in micortiterplaten

Vries de rest van de eiwitpreparaten (1/1) snel in op CO₂-ijs+EtOH en bewaar bij -70°C

Dag 4

Bepaal de totale hoeveelheid CAT in de eiwitpreparaten van dag 3 door middel van de CAT-ELISA :

Ontdooi de 10-1 verdunning (gestockeerd op -70°C) op ijs

Maak volgende verdunningen :

Gebruik 2X200 µl van de 4.10-5, de 4.10-6 en de 4.10-7 verdunning voor de CAT-ELISA

Dag 5

Voer SDS-PAGE uit op de stalen bekomen op dag 3

Ontdooi de preparaten (2 per staal - gestockeerd bij -20°C) op ijs

Centrifugeer één van de twee stalen gedurende 10 min bij 13.000 rpm
Neem voorzichtig 120 µl supernatans af en breng over in een nieuw epje + 40 µl laadbuffer (= oplosbare eiwitfractie)
Verwijder rest van het supernatans
Was pellet met 2X500 µl TE-buffer
Resuspendeer pellet in 150 µl TRIT + 50 µl laadbuffer (= onoplosbare eiwitfractie)

Voeg aan het tweede preparaat 50 µl laadbuffer toe (= totale cellysaat)

Kook staaltjes 5 min op bij 95°C en centrifugeer 2 min bij 13.000 rpm

Breng fracties van 20 µl op een 12 % SDS-polyacrylamide gel

Kleur gel met Coomassie blue na elektroforese

Benodigdheden

SDS-PAGE

Hoofdmenu | LoGT | Rob Lavigne