Randommutagenese met PCR

Standaard PCR-mengsel bevat :
200 µM van elke base
5 mM Mg2+

Om mutatiefrequentie te verhogen :
3 x 200 µM dNTP + 1 x 14 µM dNTP
200 µM dITP

Mutatiefrequentie nog te verhogen door :
0,5 mM Mn2+ aan de mix toe te voegen

PCR-mix bevat :
10 mM Tris.HCl pH 8,7
50 mM KCl
5 µg/ml BSA
0,5 µM van elke primer
600 pM template DNA
2 units Taq DNA polymerase
0,5 mM MnCl₂
0,1 - 10 mM dNTP (3 x 0,2 mM + 1 x 3,4 mM)
MgCl₂ : 0,7 + [dNTP]_totaal - [MnCl₂] mM

Opm. : hogere Mg2+-concentraties zorgen voor een sterk verlaagde PCR-opbrengst.

PCR-programma :
91°C - 1'<------+
51°C - 1' 16 cycli
72°C - 3'-------+

2. Spin down

4. Check yield of PCR product by agarose gel electroforesis (10 µl on 1% TAE agarose gel)

PCR premix (20/50)
per ml final PCR mixture
100 µl 10 x SuperTaq buffer
4 x 2 µl dNTPs (100 mM)
300 µl H₂O

Mn²⁺/Mg²⁺ solution
0,5 mM MnCl₂
5 mM MgCl₂