Transformatie- en mutagenese-protocol met Epicurian Coli XL1-Red

1. Ontdooi de Epicurian Coli XL1-Red competente cellen op ijs
2. Meng de competente cellen voorzichtig
   Verdeel 100 µl van de competente cellen uit in voorgekoelde 15 ml Falcon polypropyleenbuizen
3. Voeg 1,7 µl ß-mercaptoethanol toe (uit de kit of uit een verse 1:10 verdunning van de stockoplossing (14.2 M) in water)
   Eindconcentratie aan ß-mercaptoethanol is 25 mM
4. Meng de inhoud van de buizen voorzichtig
   Incubeer de buizen 10 min op ijs waarbij ze om de 2 min voorzichtig geschud worden
5. Voeg 10-50 ng DNA toe en meng voorzichtig
   Controle : voeg 1 µl pUC18 (0,1 ng/ml) toe aan 100 µl competente cellen
6. Incubeer de buizen op ijs gedurende 30 min
7. Breng de buizen in een waterbad op 42°C gedurende 45 sec
   Opgelet : de lengte van deze incubatie is van groot belang voor het verkrijgen van een hoge transformatie-efficiëntie
8. Incubeer de buizen 2 min op ijs
9. Voeg 0,9 ml voorverwarmd (42°C) SOC-medium toe
   Incubeer de buizen in de schudder (225-250 tpm) op 37°C gedurende 1 uur
10. Plaat ¾ 200 µl van de transformatiemengsels uit op gepaste platen (LB + antibioticum)
    Incubeer de platen op 37°C gedurende 24-30 uren
11. Ent geïsoleerde kolonies over in 5-10 ml vloeibaar LB-medium dat de gepaste antibiotica bevat. Groei deze culturen bij 37°C overnacht op
    Als een hogere mutatiefrequentie gewenst is (of bij gebruik van een plamide met laag copy-nummer) dan kunnen de cellen opnieuw verdund worden en overnacht opgegroeid worden, en dit voor zoveel cycli als gewenst.
12. Bereid miniprep DNA van 1,5 ml van de overnacht opgegroeide culturen om het willekeurig gemuteerde DNA te isoleren
13. Herhaal stappen 1-10 van het transformatieprotocol om het geïsoleerde miniprep DNA te transformeren naar Epicurian Coli XL1-Blue competente cellen.
14. Selecteer naar de gewenste mutaties

TE buffer

SOB-medium

SOC-medium (per 100 ml)

LB vloeibaar medium

LB-agar

Hoofdmenu | LoGT | Rob Lavigne