Doelstelling
Ontzouten en/of verwijderen van laagmoleculaire verbindingen uit een met FPLC opgezuiverd CAT-preparaat.
Benodigdheden :
Klemmetjes voor het afdichten van dialysemembranen
Dialyse-membranen, opgekookt in NaHCO3 (zie onder)
100 X dialyse-buffer : 100 mM NaCl
50 mM tris/HCl pH 7,5
groot recipiënt
Uitvoering
Knoop het dialysemembraan aan één zijde toe
Vul het dialysimembraan met milliQ-water en controleer of er geen lekken zijn
Breng de te dialyseren oplossingen in een membraan.
Zorg ervoor dat er geen luchtbellen ingesloten worden bij afknopen van het membraan.
Vul het dialysemembraan niet te vol, zodat een volumetoename binnen het membraan niet leidt tot scheuren.
Dialyse 1 : dialyse tegen 100-voudige overmaat 1X dialysebuffer
gedurende 2 uren op 4°C
Dialyse 2 : dialyse tegen 100-voudige overmaat 1X dialysebuffer
gedurende 2 uren op 4°C
Dialyse 3 : dialyse tegen 100-voudige overmaat H2O (milliQ)
gedurende 2 uren op 4°C
Opmerking : draag handschoenen bij de behandeling van het dialysemembraan. Hierdoor wordt contaminatie van het preparaat met micro-organismen of proteolytische enzymen beperkt.
Voorbereiding: Opkoken van dialysemembranen in NaHCO3-buffer :
bereid 2 liter buffer : 5 mM EDTA (292,2 g/mol) : 2,92 g/2 l
200 mM NaHCO3 (84,01 g/mol) : 33,6 g/2 l
Breng 1 l buffer aan de kook
Leg membranen in kokende buffer + 5 min koken
Giet kookwater weg en spoel membranen met demiwater
Kook de membranen een tweede keer gedurende 5 min in 1 l buffer
Spoel de membranen met demiwater
Autoclaveer de membranen in H2O en bewaar in frigo